اصول عملکرد دستگاه HPLC:
HPLC از دو فاز ثابت و متحرک تشکیل شده است. که فاز ثابت جامد و یا مایع (مواد متراکم شده درون ستون) و فاز متحرک مایع است. اساس جداسازی در روش های کروماتوکرافی تمایل نسبی هر جز به فاز ساکن به هنگام عبور فاز متحرک بر روی فاز ساکن است. به این صورت که گونه ای که تمایل بیشتری به فاز ساکن دارد با سرعت کمتری در طول ستون حرکت می کند و گونه ای که تمایل بیشتری به فاز متحرک دارد با سرعت بیشتری از ستون عبور می کند.
در ابتدا ترکیبات در یک حلال حل می‌شوند، سپس تحت فشار بالا داخل یک ستون کروماتوگرافی جریان می‌یابند و بدین ترتیب ترکیبات مخلوط در ستون از هم جدا می‌شوند. میزان تفکیک‌پذیری به مقدار میان کنش بین ترکیبات حل شده و فاز ثابت بستگی دارد.
انواع دستگاه HPLC:
- HPLC
- FPLC
- UHPLC
- HPLC PREPARATIVE
کاربردهای دستگاه HPLC:
HPLC یک تکنیک کروماتوگرافی متداول و بسیار قدرتمند است که کاربردهایی در زمینه هایی مانند داروسازی، تجزیه و تحلیل زیستی، مواد غذایی و آشامیدنی، بالینی، پزشکی قانونی، محیط زیست و آزمایشگاه های توسعه دارو دارد.
- کاربردهای دارویی
- کاربردهای زیست محیطی
- برنامه های کاربردی در پزشکی قانونی
- غذا و طعم
- کاربرد در تست های بالینی
بخش های اصلی دستگاه و شماتیک کارکرد دستگاه:
- سیستم انتقال حلال (پمپ)
- محل تزریق (Injector)
- ستون
- آشکار ساز
- کامپیوتر برای ارزیابی اطلاعات
مزایا:
استفاده از روشHPLC بسیار آسان است.
مدت زمان لازم برای آنالیز بسیار اندک است.
در سیستمHPLC دو فاز ثابت و متحرک با مکانیسم رقابتی عمل می کنند که این امر موجب انجام آنالیزهای دقیق می شود.
در این روشبرای هر گروه از ترکیبات خاص، دتکتورهای انتخابی ویژه وجود دارد که کمیت و کیفیت آنالیز را به بهترین صورت ممکن افزایش می دهند.
ترکیبات آلی ناپایدار و غیر فرار به سادگی تحت آنالیز قرارمی گیرند.
جداسازی، خالص سازی و شناسایی پروتئین ها و ترکیبات آلی بویژه ترکیبات دارویی با این روش به خوبی انجام می گردد.
آنالیز کمی با حساسیت و دقت زیادی امکان پذیر است.
تعیین ساختار پلیمرها
مقایسه ساختار پروتئین های مختلف
هرگونه ناخالصی با قطبیت های مختلف، قابل تشخیص است.
وجود ناخالصی هایی با وزن ملکولی بسیار بالا قابل تشخیص است.
وجود آب در نمونه های آزمایشی مشکلی در طی آنالیز بوجود نمی آورد.
سهولت تجدید پذیری(Reproducibility) از مزیت های عمده سیستم HPLC محسوب می شود.
معایب:
مشکل در خطوط الکترونیکی
مشکل در کیفیت ستون کرماتوگرافی
مشکل در جریان موبایل فاز
مشکل در دمای کروماتوگرافی
مشکل در pH جریان موبایل فاز
مشکل در نحوه تزریق نمونه
مشکل در نوع دتکتور
مشکل در کنترل کیفی تحلیل
مشکل در آنالیز نتایج
جمع‌بندی:
کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا، روشی مناسب جهت جداسازی، اندازه گیری، و تعیین نوع مواد است. این تکنیک با تلفیق با روشهای دیگر و آشکارسازهای پیشرفته ای مانند طیف سنج جرمی کاربرد های زیادی در علوم مختلف دارد. انتخاب فاز متحرک و ثابت، انتخاب آشکارساز و تعیین سرعت جریان فاز متحرک از جمله موارد اساسی در تنظیمات یک روش مناسب HPLC است.